【技术干货】本文以植物病原效应蛋白筛选为案例详细讲解酵母双杂交的实验设计、操作要点、质控标准适合生物研发、实验室技术人员直接参考使用。一、技术概述酵母双杂交是体内检测蛋白 - 蛋白互作的常用技术无需蛋白纯化可直接从 cDNA 文库中高通量筛选未知互作蛋白在植物 - 微生物互作、信号通路研究中应用广泛。针对核蛋白与膜蛋白的不同特性可分别构建核系统GAL4与膜系统split-ubiquitin文库提升筛选覆盖度。二、实验材料与体系植物材料西瓜食酸菌侵染的本氏烟叶片酵母菌株AH109核系统、NMY51膜系统载体pGBKT7、pBT3-N诱饵载体pGADT7、pPR3-N文库载体核心方法SMART cDNA 合成、酵母 PEG/LiAc 转化、缺陷型培养基筛选三、核心实验流程聚焦酵母双杂交1. cDNA 文库构建选取侵染后 7、8、9 天的本氏烟叶片混合取样提取总 RNA 并纯化 mRNA。以 mRNA 为模板采用 SMART 技术合成双链 cDNA经 Sfi I 酶切后与载体连接构建初级文库扩增后获得次级文库。质控标准核系统库容 5.4×10⁶ CFU、重组率 98%膜系统库容 6.0×10⁶ CFU、重组率 100%插入片段平均长度 1000 bp。2. 诱饵载体构建与验证克隆 AopW 基因1458 bp通过同源重组构建诱饵载体。自激活检测BD-AopW 空 AD 共转酵母在三缺、四缺培养基上不生长判定为无自激活。毒性检测诱饵载体转化后酵母生长曲线与空载组无显著差异判定为无毒性。3. 酵母双杂交筛选与验证将诱饵载体与 cDNA 文库共转酵母涂布 SD/-Trp-Leu 培养基30℃培养 3–5 天。挑取单菌落依次点种三缺、四缺 X-α-Gal 培养基以生长 显色作为阳性判定标准。提取阳性克隆质粒测序BLAST 比对得到互作蛋白 NbTIM22-2。通过一对一回转验证确认 AopW 与 NbTIM22-2 在酵母体内存在特异性互作。四、技术要点与避坑样本需覆盖不同发病阶段保证低丰度转录本不丢失。文库构建必须去除短片段提高有效库容。诱饵载体未完成验证严禁筛库避免大量假阳性。膜蛋白互作优先选择膜系统酵母双杂交传统核系统易出现假阴性。五、总结酵母双杂交技术流程成熟、结果可靠是筛选蛋白互作的核心工具。本研究建立的双文库筛选体系可直接应用于植物病原效应蛋白、抗逆蛋白、调控因子的互作筛选为农业生物研发提供稳定技术支撑。参考文献柳雨欣殷铭硕马博雅刘君。西瓜食酸菌侵染本氏烟酵母双杂交 cDNA 文库构建及 T3E_AopW 互作蛋白的筛选与验证 [J/OL]. 新疆农业科学2026.