DARTSDrug Affinity Responsive Target Stability药物亲和响应靶标稳定性技术因无需对药物进行标记已广泛应用于药物靶标发现与验证。然而实验原理虽然简单真正影响实验成功率的却是各项实验参数的精细控制。由于不同蛋白对蛋白酶的敏感程度存在天然差异药物结合后带来的稳定性提升也仅为相对变化因此建立标准化操作流程SOP并严格控制实验变量是获得稳定、高质量实验数据的重要保障。样品制备阶段应优先采用非变性裂解方式处理细胞或组织样品获取天然状态下的蛋白裂解液避免蛋白构象改变影响药物与靶蛋白之间的结合。蛋白酶浓度优化是DARTS实验中的关键步骤。Pronase链霉蛋白酶属于广谱混合蛋白酶其不同批次产品可能存在酶活差异因此正式实验前必须开展浓度梯度优化。通常建议设置1:100、1:500、1:1000及1:2000等多个酶与总蛋白比例通过比较不同条件下蛋白条带变化筛选最佳限制性酶解窗口即对照组条带部分降解而药物组条带明显保留。在Western BlotWB检测中GAPDH或β-actin等内参蛋白主要用于确认蛋白上样量是否一致并非用于评价酶解后的稳定性。如果药物没有与GAPDH发生结合加酶处理后其应与背景蛋白同步降解。若GAPDH几乎未发生降解则应首先考虑蛋白酶活性是否失效而不能直接认为实验取得成功。DARTS实验的可靠性来自于对限制性酶解条件的精准控制。通过合理设置DMSO溶剂对照组、梯度药物浓度组以及多种内参验证可有效降低背景干扰提高真实靶标蛋白的识别效率。随着高灵敏度质谱检测技术的发展DARTS-MS将在药物研发及靶标验证领域持续发挥重要作用。参考文献[1]. Zhang W, Song Y, Li C, et al. Canagliflozin Alleviates Diabetic Glomerular Endothelial Injury via Melibiose in a Microbiota-Dependent Manner. Adv Sci (Weinh). Published online May 27, 2026. doi:10.1002/advs.202517222.郑州大学第一附属医院IF14.1[2]. Liang Y, Zhang YL, Cheng TY, et al. Senkyunolide H potentiates bone marrow-derived mesenchymal stem cells therapy for liver cirrhosis by targeting MAEA to enhance ERK-driven HGF secretion. Pharmacol Res. 2026;226:108160. doi:10.1016/j.phrs.2026.108160.上海中医药大学IF10.5[3]. Zhang S, Tang L, Pu Y, et al. Patchouli alcohol triggers autophagic cell death in non-small cell lung cancer cells through targeting GNAI1 to dissociate the GNAI1/ARRB1 complex. Int J Biol Sci. 2026;22(8):4004-4024. Published 2026 Mar 30. doi:10.7150/ijbs.125690.中国上海市宝山区吴淞中心医院IF10[4]. Yang X, Lin G, Chen Y, et al. Chlorquinaldol Alleviates Lung Fibrosis in Mice by Inhibiting Fibroblast Activation through Targeting Methionine Synthase Reductase. ACS Cent Sci. 2024;10(9):1789-1802. Published 2024 Aug 28. doi:10.1021/acscentsci.4c00798.广州医科大学IF12.7